维生素B3（烟酸）检测试剂盒

VitaFast® Vitamin 烟酸试剂盒简单易用，采用微生物方法，在微孔板种定量检测食品、药品和饲料中的烟酸总量（包括添加和原生烟酸）。所有所需的试剂均包含在试剂盒中。本试剂盒共能提供96次检测（包括标准品）。使用ELISA reader (610 - 630 nm 或者540 - 550 nm)进行读数。

样品处理：

液体样品：无菌过滤、稀释

固体样品：均质样品、提取（离心）、无菌过滤和稀释

含原生烟酸的样品处理：

固体样品：均质样品、酸处理、提取（离心）、无菌过滤和稀释

所需时间：试验过程…………………………………………约60分钟

评价时间………………………………………….2分钟

孵育：       37 °C黑暗条件下44 – 48小时

标准品范围： 0.016－0.160 mg / 100g（ml）

回收率：     90－105％

Intra-assay CV for standards: < 10 %

Inter-assay CV for standards: < 10 %

VistaFast®烟酸微孔板检测试剂盒是利用微生物方法，用于定量检测食品、药品和饲料中的烟酸总量（包括添加和原生烟酸）。本微生物检测系统符合标准。

烟酸是从样品稀释提取所获得的。将稀释了的提取物和烟酸检测培养基加入包被有植物乳酸杆菌Lactobacillus plantarum (ATCC Nr. 8014)的微孔中。则Lactobacillus plantarum的生长状况取决于烟酸的含量。添加V烟酸作为标准或者作为样品混合物，细菌会一直生长直至烟酸被消耗殆尽。孵育条件应为37 °C黑暗条件下孵育44-48小时。细菌生长时新陈代谢的强度和烟酸的含量形成关系并可以绘制称标准曲线，通过ELISA reader在610 - 630 nm (或者540 - 550 nm)读取结果。

3．检测说明

水质在整个测试过程中起着十分重要的作用。本试剂盒中带有作为溶剂的无菌蒸馏水，用于重组、稀释标准品和样品的提取。附加的蒸馏水在以上过程中都是必不可少的。

要求整个检测过程中保持无菌操作。所使用的玻璃器皿保证无化学残留物、清洁剂、化学物质和微生物污染。因此，玻璃器皿使用前先用3 mol / l的盐酸漂洗，然后再用蒸馏水250 °C (482 °F)条件下加热1小时。在使用前回至室温。

样品制备和提取可以不用在无菌条件下进行。样品的过滤、稀释与检测前的准备工作则与整个检测过程一样必须在无菌条件下进行。

检测的每一个步骤都需要校正。标准品和样品应该进行3次检测（注意：官方标准中推荐3次检测方法）。未知样品应该用2份提取物的稀释液检测（误差应该小于10%）。如果在进一步稀释时烟酸提高，则可能含有抑制剂，比如重金属或者抗生素。

每个试剂盒中包含：

1 ×  96孔微孔板，包被有 Lactobacillus rhamnosus (ATCC Nr. 7469)

3 × 无菌蒸馏水 (30 ml) ，用于准备检测媒介、标准品和样品提取稀释液

3 × 烟酸检测媒介 (固体)

3 × 烟酸标准品 (固体)

3 × 烟酸缓冲液 (液体)

3 × 粘性箔

1 × 微孔板固定器

−黑暗条件下的培养箱，37 °C (98.6 °F)

−90 -100 °C (194 - 212 °F)水浴，或者高压灭菌锅

−ELISA reader 610 - 630 nm (540 - 550 nm)

−pH 测量仪

−离心机，大约10000 × g

−刻度移液枪 20 - 200 µl; 100 - 1000 µl

−灭菌微量移液枪 tips 20 - 200 µl and 100 - 1000 µl

−无菌试管 1.5 - 2.0 ml

−移液枪 5 or 10 ml

−带帽的无菌离心机管 (15 and 50 ml)

−带无菌注射器的0.2 µm无菌滤膜

−双蒸水用于样品提取(available at ifp)

−0.1mol / l HCl

−2 mol / l NaOH (0.8 g 溶解于100 ml水中)

−1mol / l HCl

−浓缩NaOH（40g / ml）

6．用户须知

−检测培养基有可能刺激眼睛、皮肤和隔膜

−完成试验后须根据规章处理检测仪器（如使用高压灭菌锅）

试剂盒应存放在2－8℃条件下

处理过的试剂（标准品、培养基）和烟酸缓冲液应马上使用，并在检测后丢弃。

将未使用的微孔板条放回原来的箔袋中，并与干燥剂一起重新封好，放在2－8℃温度下。微孔板须防止受潮或受到其他污染。

请勿在试剂盒标注的有效期之后使用。

空白的吸光度值大于标准品1。

浓度标准品的吸光度值小于0.6（630nm）。

样品应储存在4℃、避光条件下。

检测富集营养样品中的游离烟酸时，热水提取方法通常就足够了。但是富集营养的饮料可以在过滤之后直接使用。由于使用热水提取，所以原生烟酸只能被部分检测。对于检测原生烟酸总量，样品应用酸水解处理。

样品提取时需要1g或1ml样品溶解于40ml双蒸水或提取溶液中。相当于样品的稀释倍数为40，这个稀释倍数已经包括在标准曲线中。

样品提取后需要进一步稀释。稀释倍数取决于由标准曲线中间部分显示的标准浓度，它是除以其含量获得（详见产品标签或认证，每100g或100ml浓度）。至于涉及到胶囊或药片时，浓度时常表达为“/片胶囊”，此时浓度必须转化成“/100g”（详见11.的计算示例）。这个稀释倍数在计算结果的时候必须考虑。

样品提取时使用无菌滤纸（0.2μm）进行过滤，此时。如果由于固体颗粒或者浑浊导致过滤不顺利，则在无菌过滤之前应先离心（至少在8000g的离心力下离心5分钟）。

样品提取液可以在提取当天使用，使用之前应避光保存。提取稀释液应马上使用。

9.1.液体样品（富含维生素的果汁、健康饮品）

加入1ml样品至50ml无菌离心管中，准确加入双蒸水至40ml，摇匀。使用无菌0.2μm滤纸过滤1.0～1.5ml样品到一个无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。

9.2.含维生素的可溶固体样品（粉末、药片）

称取1g样品至50ml无菌试管，用双蒸水准确加至40ml刻度。摇匀至样品溶解。用0.2μm无菌滤纸过滤1.0～1.5ml样品至一无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。

9.3.维生素胶囊、药片

首先胶囊或药片的重量必须确定（平均5～10个胶囊或药片）。药片用研钵或搅拌机均质，胶囊须切开并取出其中的颗粒进行试验。

称取1g药片或切开1个胶囊至一个50ml无菌离心管中，用0.1mol / l的HCl加至30ml，摇匀。在90～100℃水浴中提取30分钟。在提取时试管须振荡至少5次。当然期间必须保证试管是否充分封闭。迅速降温至30℃以下。用2mol / l 的NaOH调整pH值至6.0～7.0。加无菌水精确至40ml。使用0.2μm无菌滤纸过滤1.0～1.5ml样品至一个无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。

9.4 含维生素的谷物、婴儿食品、面包、面粉、食品添加剂

均质样品，称量1g样品至一50ml离心管中，用双蒸水加至40ml，摇匀。在90～100℃水浴中提取30分钟。在提取时试管须振荡至少5次。当然期间必须保证试管是否充分封闭。迅速降温至30℃以下。使用0.2μm无菌滤纸过滤1.0～1.5ml样品至一个无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。

9.5.原生烟酸

提取复合物时，检测含原生烟酸的样品必须先经过用酸处理。

称量1g样品至至一个50ml无菌离心管中，用1mol / l的盐酸加至30ml，摇匀。在90～100℃水浴中提取3小时。当然期间必须保证试管是否充分封闭。水浴提取期间离心管必须至少振荡5次。迅速降温至30℃以下。用固体或2mol / l 的NaOH调整pH值至5.0～6.0。用双蒸水准确加至40ml处。使用0.2μm无菌滤纸过滤1.0～1.5ml样品至一个无菌试管中。是否进一步稀释则取决于浓度范围（详见计算示例中的稀释倍数）。

10.检测过程

10.1.准备

装有无菌水的瓶子：推开蓝色帽，沿着玻璃边缘垂直向上拉开，丢弃。

烟酸培养基：足够进行至少6条微孔板试验，培养基必须在试验之前新鲜制备。打开瓶盖用镊子从干燥剂中取出培养基，丢掉干燥剂。

－加入10ml无菌水（取自试剂盒中）至烟酸培养基中

－盖好培养基瓶，摇匀

－在90～100℃水浴中加热至少5分钟，期间振荡至少5次；期间保证瓶子封闭

－迅速冷却至室温（低于30℃）

－使用0.2μm无菌滤纸过滤培养基至15ml无菌离心管中

每个烟酸标准品都足够进行至少3个孔的试验。标准品必须在试验之前新鲜制备。

－打开维生素烟酸标准品瓶，取出盖子。丢掉盖子和红色塞子

－加入x ml（x＝详见质量保证书）无菌水（取自试剂盒）至标准品瓶中。用移液管溶解标准品：用标准品瓶中的水冲洗移液管尖数次＝标准品浓缩液

－取6个无菌管（1.5～2.0ml）并按照下列表格准备标准品溶液。

10.2.检测过程

－用移液管吸取150μl烟酸培养基至微孔中

－用移液管吸取150μl标准品货样品至指定的微孔中（用标准品或样品溶液冲洗移液管尖）

－用粘合箔盖住微孔条或微孔：除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手或压舌板将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。

注意：保证粘合箔和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘部分

－在37℃黑暗条件下（可用孵育器）孵育44～48小时

10.3.测量

－再次向下挤压粘合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物溶解在培养基中

－对角揭去粘合箔，从左边开始进行

－破坏微孔液体表面所有的泡沫（可以用移液管尖去除）

－用ELISA reader 610～630nm（或540～550nm）条件下读取浑浊度

注意：

－当孵育44～48小时后，微孔板能在冰箱里最多储存48小时，因此必须在这个时间段内测量混浊度

－为了避免由于假期或周末所产生的时间上的损失，微孔板能在60小时之后进行评估计算。推荐使用定时器在48小时之后关闭孵育器。

11.计算

推荐在计算结果时使用必发公司提供的配套软件。

样品稀释倍数40已经包括在标准曲线中（详见质量保证书）。在下面的公式中，只需要考虑提取的进一步稀释倍数和不同的样品重量。

                      从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数

烟酸    ＝ ────────────────────

（mg/100ml）                   样品总量（ml）

                     从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数×0.901

烟酸    ＝ ────────────────────────

（mg/100g）                    样品总量（g）

                      从标准曲线上读取的浓度×稀释倍数

烟酸    ＝ ────────────────────

（mg/100g）                     样品总量（g）

从标准曲线上读取的浓度×药片重量（g）×稀释倍数

烟酸＝ ──────────────────────────

（mg/药片）                       100×样品总量（g）

样品提取的稀释倍数计算示例

提取液稀释应在标准曲线中间区域。因此，浓度应除以标准2

计算：    3mg ÷ 0.032mg ＝ 93.75

          → 结果为稀释倍数大约为100

→ 1 ： 100 稀释

1 ： 100

1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）， 1 ： 10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）

计算：     3mg / 片，平均重量1g

           ＝ 300mg / 100g

300mg ÷ 0.032 mg ＝ 9375

→结果为稀释倍数大约为10000

→1 ：10000稀释

1 ：10000

1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）

1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml），1 ：10（0.1 ml ＋ 0.9 ml）