中检维康VITAMIN B12维生素B12免疫亲和柱

                                 （产品编号：IAC315）     

联系人：薛丽丽

电话：15010301983

使用对象

IAC-SEP^®维生素B₁₂亲和柱能够特异性的纯化样品中的维生素B₁₂，它采用了柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与维生素B₁₂抗体偶联形成免疫吸附剂，装柱制成免疫亲和柱。它能够特异性的纯化样品中的维生素B₁₂。维生素B₁₂亲和柱广泛地应用于饮料、牛奶和奶粉，饮料等样品的提取，该方法速度快、操作简单、准确性高，对提高食品的质量和安全性起到十分重要的作用。

维生素 B12家族中有四大成员：氰钴胺、架胺、腺苷钴胺和羟钴胺. 自然界中，微生物生物合成的维生素B12终形式为架胺、腺苷钴胺和羟钴胺;但是由于它们性质不太稳定，所以在工业提纯过程中人为地加入，使天然形式的维生素B12转化为性质更为稳定的氰钴胺。我们俗称的维生素B12，是指氰钴胺，我们食品中添加的维生素B12为氰钴胺，因此我们检测食品中的维生素B12只需检测氰钴胺。

该说明书方法应用亲和柱方法检测食品中维生素B12（氰钴胺）的检测方法。如需检测氰钴胺、架胺、腺苷钴胺和羟钴胺总量的方法，请参考以下两种方法进行样品的前处理，然后再应用本亲和柱进行净化：

AOAC2014.02:Improved_AOAC-FirstAction 2011.08 for the Analysis of Vitamin B12 in Infant Formula and Adult Pediatric Formulas First Action 2014.02(2)

原理

维生素B₁₂免疫亲和柱能够特异性的纯化样品中的维生素B₁₂，将样品与提取液混合、提取、过滤，然后将滤液通过免疫亲和柱。此时，维生素B₁₂物质键合在亲和柱中的抗体上。用蒸馏水将免疫亲合柱上的杂质除去。用甲醇通过分离柱，将维生素B₁₂从抗体上分离下来。，将过滤的甲醇溶液注入HPLC或LC-MS进行测定。

储存条件

该亲和柱保存在2-8 °C条件下，不能冷冻，保质期为18个月。建议在室温（18-30°C）下使用。

实验溶液制备

     磷酸盐溶液：50mmol/L KH2PO4（用磷酸调节pH至3.5），过滤膜。

     pH7.4 PBS溶液：8.0 克NaCl + 2.90克Na₂HPO4 12H₂O + 0.24 克 KH₂PO4 + 0.2克KCl  加990mL纯水溶解，加纯水至1升。

     50mM乙酸钠缓冲液（pH 4.0）：4.1g 乙酸钠加990mL纯水溶解，用乙酸调节pH为4.0，加纯水至1升。

液相色谱条件

色谱柱：Cloversil-C18,4.6×250mm（5um）

流动相：磷酸盐溶液:乙腈=85:15（v/v）

流速：1.0 mL/min

检测器：紫外检测器，361nm

进样体积：20-100uL

将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下。将上述样品5-50mL（根据柱容量和灵敏度选取合适体积）提取液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约2mL/min（1-2滴/秒）流速缓慢通过免疫亲和柱，直至液面下降到亲和柱管体（未完全流干）。以2-3mL/min（1-2滴/秒）流速用10.0mL水淋洗，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体。准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min（1滴/秒），收集全部洗脱液于玻璃试管中， 50 °C下氮气浓缩吹干后，用流动相定容至0.5 mL，供HPLC或LC-MS分析。
注意事项

1)       不要随便更改操作说明书中的操作步骤，如需更改要和本公司技术部联系，确认更改是否合理。

2)       操作步骤中，样品过柱，淋洗，洗脱时，一定要控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低。

3)    如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准上柱液中甲醇浓度不要超过10%，否则会影响柱子的吸附能力。

4)    试验中使用的玻璃仪器等，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器。

需要准备的设备及试剂（中检维康提供）