登革热检测试剂捕获法

 Panbio Dengue IgG Capture ELISA

产品目录号01PE10

预期用途

Panbio Dengue IgG Capture ELISA用于推断性定性检测登革热病毒（1-4血清型）继发性感染患者的IgG抗体升高，辅助临床实验室诊断出现登革热病毒感染临床症状的患者，而且应该与Panbio Dengue IgM Capture ELISA和Dengue Early ELISA联用。Dengue Early ELISA也可检测原发性登革热病毒感染。PanbioDengue IgG Capture ELISA可在疾病发作后3天检测到提示继发性登革热感染的高IgG水平。然而，准确诊断继发性感染的峰值检测窗口是在疾病发作后6-15天。阳性结果是推断出来的，必须经过病毒分离培养、配对血清分析、免疫组织化学抗原检测或病毒核酸检测来确认登革热病毒感染。

概述

登革热病毒是黄病毒属，主要分布于热带和亚热带地区。世界上一半以上的人口居住于具有登革热潜在传播风险的地区，登革热是导致人类发病和死亡严峻的虫媒病毒疾病1。登革热病毒有4种不同但抗原相

关的血清型，通过雌蚊（主要是埃及伊蚊、白纹伊蚊传播和波利尼西亚斑蚊）传播。

登革热病毒感染的临床表现各不相同，从亚临床表现到致命。依据严重程度，该疾病被分为以下等级：非特异性发热疾病，典型登革热，登革出血热（DHF）（1级和2级），和登革休克综合征（DSS）（3级和4级）

1。典型登革热的特征是突然发热并至少伴随以下2种症状：头痛，眼眶后疼痛，肌痛，关节痛，皮疹，出血表现，和球减少症

2。双相发热病程常见和厌食，失去味觉或口苦。DHF和DSS是严重的潜在致命性并发症，通常与感染第二种血清型有关

3。在地方性流行登革热感染的国家，大部分成年患者会出现继发性登革热感染4。利用ELISA方法检测登革热病毒的IgG抗体特异性升高是鉴别继发性登革热感染非常重要的诊断方法。继发性感染患者并发症的发生几率较高5,6。传统上，血凝抑制试验（HAI）滴度被用于划分原发性或继发性感染。当前的界定方法是采用及时分离至少7天的配对血清标本检测，急性标本的HAI滴度> 1:1280被认为患者感染了继发性黄病毒7。

Panbio Dengue IgG Capture ELISA是除HAI检测之外另一种可对继发性登革热感染的血清学进行诊断的方法。

如下所示，继发性登革热病毒感染的特征表现为高IgG水平，同时可能伴随IgM水平升高8。Panbio Dengue IgG Capture ELISA用于检测登革热感染的IgG抗体水平相对于阈值特异性升高。该试验不用于检测既往感染引起的低水平IgG抗体，这种情况通常见于地方性流行区的较多人群。因此，高IgG水平（> 22 Panbio单位）提示继发性登革热病毒感染。

Panbio Dengue IgG Capture ELISA

产品目录号01PE10

预期用途

Panbio Dengue IgG Capture ELISA用于推断性定性检测登革热病毒（1-4血清型）继发性感染患者的IgG抗体升高，辅助临床实验室诊断出现登革热病毒感染临床症状的患者，而且应该与Panbio Dengue IgM Capture ELISA和Dengue Early ELISA联用。Dengue Early ELISA也可检测原发性登革热病毒感染。PanbioDengue IgG Capture ELISA可在疾病发作后3天检测到提示继发性登革热感染的高IgG水平。然而，准确诊断继发性感染的峰值检测窗口是在疾病发作后6-15天。阳性结果是推断出来的，必须经过病毒分离培养、配对血清分析、免疫组织化学抗原检测或病毒核酸检测来确认登革热病毒感染。

概述

登革热病毒是黄病毒属，主要分布于热带和亚热带地区。世界上一半以上的人口居住于具有登革热潜在传播风险的地区，登革热是导致人类发病和死亡严峻的虫媒病毒疾病1。登革热病毒有4种不同但抗原相

关的血清型，通过雌蚊（主要是埃及伊蚊、白纹伊蚊传播和波利尼西亚斑蚊）传播。

登革热病毒感染的临床表现各不相同，从亚临床表现到致命。依据严重程度，该疾病被分为以下等级：非特异性发热疾病，典型登革热，登革出血热（DHF）（1级和2级），和登革休克综合征（DSS）（3级

和4级）1。典型登革热的特征是突然发热并至少伴随以下2种症状：头痛，眼眶后疼痛，肌痛，关节痛，皮疹，出血表现，和球减少症2。双相发热病程常见和厌食，失去味觉或口苦。DHF和DSS是严重的潜在致命性并发症，通常与感染第二种血清型有关3。

在地方性流行登革热感染的国家，大部分成年患者会出现继发性登革热感染4。利用ELISA方法检测登革热病毒的IgG抗体特异性升高是鉴别继发性登革热感染非常重要的诊断方法。继发性感染患者并发症的发

生几率较高5,6。传统上，血凝抑制试验（HAI）滴度被用于划分原发性或继发性感染。当前的界定方法是采用及时分离至少7天的配对血清标本检测，急性标本的HAI滴度> 1:1280被认为患者感染了继发性黄病毒7。

Panbio Dengue IgG Capture ELISA是除HAI检测之外另一种可对继发性登革热感染的血清学进行诊断的方法。

如下所示，继发性登革热病毒感染的特征表现为高IgG水平，同时可能伴随IgM水平升高8。Panbio Dengue IgG Capture ELISA用于检测登革热感染的IgG抗体水平相对于阈值特异性升高。该试验不用于检测既往感染引起的低水平IgG抗体，这种情况通常见于地方性流行区的较多人群。因此，高IgG水平（> 22 Panbio单位）提示继发性登革热病毒感染。

# Panbio Dengue Duo Cassette和IgG Capture ELISA的临界值。近似等于HAI滴度2560。

* Panbio Dengue Duo Cassette和IgM ELISA的临界值。^继发性感染的IgM水平可能检测不到。

检测原理

血清中存在的登革热病毒IgG抗体，与微孔测试条（测定板）上聚苯乙烯表面包被的抗人IgG抗体结合。用抗原稀释剂将浓缩的重组登革热1-4型抗原溶液稀释到正确的工作容积。用昆虫细胞表达系统产生抗原，用特异性单克隆抗体纯化抗原。在稀释后的抗原中添加等体积的辣根过氧化物酶（HRP）标记单克隆抗体（MAb），形成抗原MAb复合物。清洗测定板上的剩余血清，将抗原MAb复合物添加到测定板中。然后这些抗原MAb复合物与血清登革热特异性IgG抗体结合。在培养完成后清洗微孔，再添加无色的底物系统-四甲基联苯胺/过氧化氢（TMB显色液）。底物被HRP（如存在）水解后，显色液变蓝。用酸终止反应后，TMB变黄。显色表示测试样本中存在抗登革热IgG抗体。

提供的材料

抗人IgG包被微孔-（测定板）

（12x8孔）。即用型。未使用的微孔应该立即重新密封并储存于干燥环境中。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

登革热1-4型抗原（重组）-1瓶，无色瓶盖，包含150μL（红色）浓缩的1型、2型、3型和4型登革热病毒抗原。未使用的稀释抗原必须丢弃。浓缩抗原在有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

清洗缓冲液（20倍）-1瓶，60mL 20倍浓缩磷酸盐缓冲盐水（pH 7.2–7.6），含吐温20和防腐剂（0.1% Proclin™）。低温可能结晶。若去除结晶，可在37℃孵育液体至澄清。混合均匀。用19体积的蒸馏水稀释1体积的清洗缓冲液。稀释后的缓冲液可在2-25℃储存一周。

样本稀释剂–2瓶，50 mL（粉色）。即用型。Tris缓冲生理盐水（pH 7.2–7.6），含防腐剂（0.1%Proclin™）和添加剂。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

抗原稀释剂–1瓶，50mL（无色）。即用型。磷酸盐缓冲液，含防腐剂（0.1% Proclin™和0.005%庆大霉素）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

HRP标记单克隆抗体示踪剂–1瓶，7mL（绿色）。即用型。辣根过氧化物酶（HRP）标记单克隆抗体示踪剂，含防腐剂（0.1% Proclin™）和蛋白稳定剂。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

TMB显色液（TMB）-1瓶，15mL。即用型。3,3’,5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢的混合物，存放于枸橼酸盐缓冲液中（pH 3.5–3.8）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

反应控制品–1瓶，红色瓶盖，200μL人血清（含0.1%叠氮化钠和0.005%硫酸庆大霉素）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

校准品–1瓶，黄色瓶盖，400μL人血清（含0.1%叠氮化钠和0.005%硫酸庆大霉素）。有效期内储

存于2-8℃可保持稳定。

阴性质控品–1瓶，绿色瓶盖，200μL人血清（含0.1%叠氮化钠和0.005%硫酸庆大霉素）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。

11.终止液–1瓶，红色瓶盖，15mL。即用型。1M磷酸。有效期内储存于2-25℃可保持稳定。Proclin™ 300是Rohm和Haas公司的注册商标。

需要但未提供的材料

精确、可调节的微量移液器，含一次性吸液头（5-1000 μL容积）

去离子水

标板清洗系统

酶标仪，含450nm滤波器

计时器

刻度量筒

烧瓶

试管或微滴定板，用于稀释血清

注意事项

用于体外诊断

在制备质控品的过程中使用的所有人源性材料已经过人类免疫缺陷病毒1/2（HIV 1/2）抗体、丙肝（HCV）和乙肝表面抗原的检测，结果为阴性。但是，任何测试方法都不能完全确信，且所有人源性质控品和抗原都应按照潜在传染性材料处理。疾病控制和预防中心以及美国国立卫生研究院建议将潜

传染原按照生物安全二级处理9。

该测试只能使用血清执行。尚未建立使用全血、血浆或其它标本基质的方法。

不可使用黄疸或脂血症血清，以及出现溶血或微生物生长的血清。

不可加热，否则血清将失去活性。

在开始检测前所有试剂必须平衡至室温（20-25℃）。检测受温度变化的影响。微孔板在达到室温（20-25℃）之前不可从密封袋中取出。

直接用干净的吸液头从试剂瓶中吸出试剂。转移试剂可能导致污染。

未使用的微孔应该立即重新密封并储存于干燥环境中，否则将产生错误结果。

底物系统：

(1)由于TMB易受金属离子的污染，所以底物系统不能与金属表面接触。

(2)避免长时间阳光直射。

(3)有些清洁剂可干扰TMB的性能。

(4)TMB可能呈现淡蓝色，这不影响底物的活性或测定结果。

某些试剂盒组成包含叠氮化钠，叠氮化钠可能与铅或铜管反应形成极易爆炸的金属叠氮化合物。通过管道装置处理这些试剂时，请用大量清水冲洗以避免叠氮化物在排水管内累积。

叠氮化钠还抑制酶标物的活性。在添加酶标物时必须使用干净的吸液头，避免携带其它试剂的叠氮化钠。

根据适用的欧洲共同体（EC）指令，产品组成的危害信息如下：

标本采集和制备

静脉穿刺获取的血液应该置于室温（20-25ºC）下直到凝块形成，再按照临床实验室标准化研究院（CLSI）的《认可标准——诊断用血液标本的静脉穿刺采集程序，H3》离心。

应该尽快分离血清。如果在2天内不进行检测，血清应该2-8℃冷藏或低于-20℃冷冻储存。不推荐使用自解冻冷冻机储存血清。不推荐使用黄疸血清，以及出现溶血、脂血或微生物生长的血清。CLSI提供了储存血液标本的建议《认可标准——血液标本的处理加工程序，H18》。

检测程序

注：确保所有试剂在开始测定前平衡至室温（20-25℃）。未在规定的时间和温度范围内进行检测可能产生无效结果，不符合规定的检测应重新实施。

血清预稀释

从铝箔袋中取出所需数量的微孔板并插入测试条槽。阴性质控品（N）、反应质控品（R）和校准品（CAL）各需5个微孔，一式三份。确保剩下未使用的微孔密封于铝箔袋内。

使用适当的试管或微滴定板稀释阴性质控品、反应质控品、校准品和患者样本：

（1）混合10μL血清与1000μL样本稀释剂。混合均匀。或者，

（2）混合10μL血清与90μL样本稀释剂。取出20μL稀释血清，加入180μL样本稀释剂。混合均

匀。

ELISA程序

方法概述见附图。

(1)抗原

确定检测需要的微孔数量。使用抗原稀释剂按照1/250稀释抗原。建议至少用2.5mL抗原稀释剂稀释10μL抗原。这个量足够5个测试条（40个孔）使用。每个测试条需要0.5mL稀释抗原。一旦抗原与抗原稀释剂混合，溶液就变成淡红色。确保剩下未使用的浓缩抗原储存于2-8ºC。

取出所需体积的稀释抗原，在干净的玻璃或聚丙烯瓶中与Mab示踪剂等体积混合。轻轻混合抗原-Mab示踪剂溶液，并将其置于室温（20-25ºC）下直到孵育完成（60分钟）。丢弃未使用的稀释抗原。

(2)测定板

Mab示踪剂与稀释抗原混合后10分钟内，吸取100μL稀释患者样本和质控品添加到相应的微孔中。

盖住测定板，在37ºC ± 1ºC孵育60分钟。

用稀释后的清洗缓冲液洗6次（参考清洗程序）。

在转移之前混合抗原-Mab示踪剂溶液。从抗原瓶中吸取100μL抗原-Mab示踪剂复合物添加到测定板的适当微孔中。

盖住测定板，在37ºC ± 1ºC孵育60分钟。

用稀释后的清洗缓冲液洗6次（参考清洗程序）。

吸取100μL TMB添加到每个孔中。

在室温（20-25ºC）下孵育10分钟，从次添加开始计时。蓝色将会显现。

按照相同顺序吸取100μL终止液添加到每个孔中，计时同TMB添加步骤。混合均匀。蓝色将变成黄色。

在30分钟内读取每个孔在450nm波长的吸光度，参考滤波器为600-650nm。

注：如果使用双波长分光光度计，将参考滤波器设定在600-650nm之间。在没有参考滤波器的情况下读取450nm的微孔结果可能由于背景原因导致吸光度偏高。

清洗程序

为了清除未复合的样本或成分，有效清洗是ELISA程序的关键步骤。

自动洗板机

(1)彻底抽净所有微孔。

(2)在清洗循环期间将每个孔装满至边缘（350μL）。

(3)完成6次清洗后，将测定板倒立于吸水纸巾上用力敲打，确保清除所有清洗缓冲液。

(4)为了确保有效清洗，必须维持自动洗板机良好的保养。必须始终遵守厂商的清洁说明。

手动清洗

(1)将测定板的内含物丢弃到适当的废物容器。

(2)用适当的挤压瓶将微孔填满清洗缓冲液。避免清洗缓冲液起泡，否则会降低清洗效率。立即丢弃微孔里的清洗缓冲液。

(3)再将微孔填满清洗缓冲液，并立即丢弃。

(4)重复步骤（3）4次，共用清洗缓冲液清洗六（6）次。

(5)一次清洗完成后，丢弃微孔的内含物并将测定板置于吸水纸巾上敲打，以确保清除所有清洗缓冲液。

质量控制

每个试剂盒包含校准品，反应质控品和阴性质控品。这些组成的可接受值参见附带的规格表。阴性质控品和反应质控品用于监测重大的试剂失败。反应控制品不能确保测定临界值的精密度。如果质控品或校准品的任一吸光度读数不符合规定，则测试无效且必须重新测试。如果测试无效，则不能报告患者结果。必须按照地方、州和/或联邦法规或认证要求以及实验室标准QC程序执行质控（QC）要求。

有关适当的QC操作规程指南，建议用户参考CLSI C24-A和42 CFR493.1256。

运算

重要提示：校准系数是针对批次的，详见规格表。在开始计算之前获取校准系数值。

计算校准品三份平行试样的吸光度平均值，乘以校准系数，得出临界值。

用样本吸光度除以（以上第1步得出的）临界值，计算指数值。

或者，

用（以上第2步得出的）指数值乘以10，计算Panbio单位。

指数值=样本吸光度/临界值

例如：样本A吸光度=0.949样本B吸光度=0.070

校准品的平均吸光度=0.802校准系数=0.62

临界值=0.802x0.62=0.497

样本A的指数值(0.949/0.497) = 1.91样本B的指数值(0.070/0.497) = 0.14

Panbio单位=指数值x 10

样本A的Panbio单位1.91x10= 19.1样本B的Panbio单位0.14x10= 1.4

结果判读

Panbio Dengue IgG Capture ELISA推断性检测患者血清中的登革热病毒IgG抗体水平升高。阳性结果（>22 Panbio单位）提示活动性继发感染。如果怀疑患者是原发性登革热感染，则该测定应该与Panbio Dengue IgM Capture (01PE20) ELISA联用。