口蹄疫病毒RT-PCR检测试剂盒

【试剂盒简介】

口蹄疫病毒（FMDV）RT-PCR 检测试剂盒，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR ）技术检测疑似感染动物的水疱皮或水疱液中所有血清型的FMDV，适用于FMDV的检测、诊断和流行病学调查。

【试剂盒原理】

利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带。 

【试剂盒组份】

【试剂盒保存条件及有效期】

1. 大盒请保存于室温，小盒请保存于-20℃。

2. 有效期为半年。 

【需自备的材料】

生理盐水、组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、经焦碳酸二乙酯（DEPC ）处理的灭菌1.5mL 离心管和吸头、琼脂糖、TAE电泳液、染色液。

【注意事项】

1．各试剂请在规定的温度储存。

2．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期的试剂。

3. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度，建议3次内用完。

4．请严格按试剂盒说明书操作，移液、定时等全部过程必须精确。

5. 保存于-20℃的试剂使用前请完全融化，并瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回-20℃。

6．注意防止试剂盒组分受污染，试剂盒之间的组分不要混用。

7．RNA提取过程中，请戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间。

【操作方法】

一、样品制备

1 样品采集：病死或扑杀的偶蹄动物，取溃烂或溃疡的表皮组织等；待检的活动物，取水疱皮或水疱液置于50%甘油生理盐水中，2～8 ℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。） 

2 样品处理： 

2.1 组织样品的处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。

2.2 水疱液的处理：取200 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。

2.3 阳性对照的处理：混匀后，取100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。

2.4 阴性对照的处理：混匀后，取100 µL于1.5 mL 灭菌离心管中。

二、病毒RNA的提取

1. 往裂解液中加入77.6µL BME，充分混匀。（加入了BME的裂解液请放4℃保存）

2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600µL裂解液，充分颠倒混匀，室温静置10min 。

3. 加入600µL异丙醇，颠倒混匀。

4. 吸取650μL混合液转入吸附柱中，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。

5. 重复步骤4。

6. 向吸附柱中加入600µL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。 

7. 重复步骤6。

8. 空柱12,000 rpm 离心2 min。 

9. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在膜中央加入25µL洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm 离心45s，获得总RNA。 

三、RT-PCR

1. 反应体系配制：每份总体积20 µL，分别取16.8µL RT-PCR反应液A（用前混匀）、1.2µL RT-PCR反应液B和2µL模板RNA（阳性对照管加入1µL阳性对照RNA和1µL阳性模板添加液），混匀。

2. 反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min ；95 ℃ 15 s 、60℃ 30 s ，35个循环；60℃延伸3 min。

四、电泳

1. 配制2 %琼脂糖凝胶。（请自备TAE电泳液、琼脂糖和染色液。）

2. 取10μL PCR产物点样于凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳。

3. 当溴酚兰电泳至凝胶中下部时结束电泳，在紫外灯下观察结果。

【结果判断】

阳性对照出现131bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现131bp扩增带为口蹄疫病毒阳性，否则为阴性。

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