动物源性食品中喹诺酮类、磺胺类、四环素类药物残留合检

—液相色谱-串联质谱法

 1 范围

本方法规定了动物源性食品中畜、禽、鱼、虾等肌肉组织喹诺酮类、磺胺类、四环素类药物残留量液相色谱-串联质谱测定方法。

2 方法原理

肌肉组织中的喹诺酮类、磺胺类、四环素类药物经提取、固相萃取净化、洗脱，洗脱液用液相色谱质谱联用仪检测。该方法具有以下创新点：

2.1 合检技术：一次性前处理可同时检测三大类残留药物，降低检测成本，提高检测效率。

2.2 试剂用量少，对环境污染小，同时对操作人员的健康危害小。   

2.3 前处理过程中，无需将试剂挥干，省去了空气流去除大量试剂的过程，前处理时间缩短一倍以上。

2.4 操作简便、快速，结果稳定可靠。

3 试剂和材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 喹诺酮类、磺胺类、四环素类合检快速前处理试剂盒

规格： 20样/盒       

3.2 乙腈：色谱纯。

3.3 甲醇：色谱纯。

3.4 甲酸：色谱纯。

3.5 0.1%甲酸溶液：准确吸取1 mL甲酸于1000 mL容量瓶中，用水稀释到刻度，混匀。

3.6 磺胺类标准物质：磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、甲氧苄啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶，纯度≥99%。

3.7 磺胺类标准储备溶液（0.1 mg/mL）：分别准确称取适量的每种磺胺标准物质，用乙腈配成0.1 mg/mL的标准储备溶液，该溶液在-20 ℃避光保存，有效期12个月。

3.8 磺胺类混合标准中间溶液（10 μg/mL）：准确移取适量的各种磺胺类标准储备溶液（3.7），用乙腈稀释至10 μg/mL，-20 ℃避光保存，有效期6个月。

3.9 磺胺标准工作溶液：根据需要取适量磺胺类混合标准中间溶液（3.8），用乙腈稀释成合适浓度的标准工作液，现用现配。

3.10  喹诺酮类标准物质：培氟沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、洛美沙星、单诺沙星、双氟沙星，沙拉沙星、司帕沙星，纯度≥99%。

3.11  喹诺酮类标准储备溶液（1 mg/mL）：分别准确称取适量的每种喹诺酮标准物质，用甲醇配成1 mg/mL的标准储备溶液，-20 ℃避光保存，有效期3个月。

3.12  喹诺酮类混合标准工作液（10 μg/mL）：准确移取适量的各种喹诺酮类标准储备溶液（3.11），用甲醇稀释配成混合标准工作液，使各组分浓度为10 μg/mL，4 ℃避光保存，有效期3个月。

3.13  四环素类标准物质：土霉素、四环素、金霉素、强力霉素，纯度≥95%。

3.14  四环素类标准储备溶液（0.1 mg/mL）：准确称取适量的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质，分别用甲醇配成0.1 mg/mL的标准储备溶液，-18 ℃避光保存，有效期12个月。

3.15  四环素类混合标准工作溶液：根据需要取适量四环素类标准储备溶液（3.14），用甲醇稀释成适当浓度的混合标准工作溶液，现用现配。

3.16  基质标准混合工作溶液：根据每个项目的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准工作溶液，基质混合标准工作溶液在4℃保存，可使用1周。

3.17  混合提取剂：将试剂盒中的提取剂1与提取剂2按1：10（V：V）的比例混合，摇匀备用，现用现混。

4 仪器

4.1 绞肉机/均质机、离心管架、天平、离心机、移液枪、可调式旋涡混合器。

4.2 50 mL离心管、15 mL离心管、5 mL离心管、30 mL注射器筒。

4.3 SPE快速前处理装置（负压式）：废液收集缸、测试液收集架、上盖板（包含12通道上下接头及排气阀）、真空泵（空气泵）。

4.4 液相色谱-串联质谱仪。

5 样品制备

Ø 称取5.0 g绞碎或均质后的组织样品于50 mL离心管中，加入8 mL 混合提取剂（3.17），剧烈振摇5 min，10000 r/min离心5 min，取上清液于另一支50 mL离心管中，用玻璃棒捣散残渣，向残渣中再加入8 mL混合提取剂（3.17），重复提取2次，合并三次的提取液，混匀，10000 r/min离心5 min。

Ø 依次用5 mL甲醇、5 mL提取剂2激活固相萃取柱，取12 mL合并的提取液上清液过柱，控制流速2 mL/min，用5 mL水淋洗萃取柱并挤干，用0.7 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，用0.1 %甲酸溶液（3.5）定容至1 mL即得喹诺酮、磺胺、四环素类合检的待测液。

注：本步操作可在固相萃取装置上进行，具体过程如下：

1）把所需数量的固相萃取柱连接好注射器筒并安装在固相萃取装置上，打开上下接头阀门，依次用5 mL甲醇、5 mL提取剂2激活固相萃取柱，取12 mL合并的提取液上清液过柱，用真空泵和排气阀控制流速2 mL/min，待提取液全部流过固相萃取柱后，用5 mL水淋洗柱子，取下注射器筒，再持续抽10 s后，扭动排气阀至指针回0，关闭真空泵。

2）将5 mL离心管对应固相萃取柱的位置放入测试液收集架上，并将其置于废液收集缸中，将上盖板放在收集缸上，确保将上盖板下方的管道与离心管对准，向固相萃取柱中加入0.7 mL洗脱液，随后开启真空泵，旋动排气阀使液体全部缓慢流过固相萃取柱，待洗脱液全部流过固相萃取柱后，再持续抽10 s，扭动排气阀至指针回0，关闭真空泵，将离心管中液体用0.1%甲酸溶液（3.5）定容至1 mL即得喹诺酮、磺胺、四环素类合检的待测液。

Ø 将待测液过0.2 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

6 测定

按实验室现用的喹诺酮、磺胺、四环素类的液相色谱串联质谱条件测定即可；如有需要，可联系生产商索要可供参考的仪器条件。

7 定量限

本方法喹诺酮类药物的定量限是1 µg/kg，磺胺类药物的定量限是10 µg/kg，四环素类药物的定量限是50 µg/kg。

8 含量计算关键点（分取比例）

    喹诺酮类、磺胺类、四环素类药物的分取比例均是1/2。

9 注意事项

9.1 做样品加标时，控制加入样品的标准溶液的总体积小于100 μL；建议配制待检项目的混合标准溶液。

9.2 离心后样品残渣会成块状，取出上清液后可用玻璃棒将样品残渣捣散，再进行下一步振荡提取操作，以保证提取效率。

9.3 如合并的提取液离心后依然有浑浊，过柱时可在注射器筒中铺一薄层脱脂棉和滤纸，以免堵塞固相萃取柱。

9.4 提取液过柱及洗脱时，控制液体流速，不要成股流下，逐滴流下为宜。