[禽病检测]新城疫抗体检测ND

中文说明书

Synbiotics鸡新城疫抗体检测试剂盒

Newcastle Disease Antibody Test Kit(NDV)

概述和用途

鸡新城疫病毒（NDV）能导致鸡群从轻度呼吸道症状到严重和死亡的一种范围较广的病原体。该病毒感染鸡群导致的发病的严重程度跟毒株有关。强毒株感染8日龄大的雏鸡能导致眼组织肿胀，和死亡。中等毒株能经呼吸道急性感染鸡群，导致严重的呼吸道症状和产蛋下降。弱毒株感染鸡群能导致轻度的呼吸道症状。Snyder和他的同事已经报道过用ELISA方法评价鸡群ELISA抗体水平。

美国辛百克斯生产的ProFLOK牌的新城疫ELISA试剂盒能检测鸡血清样品中NDV抗体。该试剂盒的主要用途是用于SPF鸡新城疫抗体的监测、雏鸡NDV母源抗体和鸡群免疫新城疫前后新城疫抗体水平的检测。

原理

本试剂盒的设计用于检测鸡血清中新城疫病毒（NDV）抗体相对水平。本试剂盒将鸡新城疫病毒（NDV）抗原包被微孔，待检血清加入包被微孔后的孵育阶段，血清中的特异性抗NDV抗体和包被的NDV抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物，洗涤液去除未反应的多余抗体，加入亲和纯化的过氧化物酶标记的酶标抗体，酶标抗体与吸附于包被抗原的抗体结合；孵育后，洗涤去除未结合的酶标抗体；加入酶底物显色。颜色反应与待检血清中NDV抗体的量直接相关。

90个待检样品所需试剂

A）1块包被NDV抗原的酶标板

B）10ulNDV阳性对照血清

C）10ul阴性对照血清（NCS）

D）100ul山羊抗鸡酶标二抗IgG（H+L）酶标记物

E）40ml样品稀释液

F）10ml氢化ABTS底物溶液

G）2.3ml 5倍浓缩的终止液，用双蒸水或去离子水作1:5稀释

H）20ml 20倍浓缩的洗涤液，用双蒸水或去离子水作1:20倍稀释。

注意：所有的试剂必须在2-7℃保存，不能冻存。

所需器材

a) 高精度移液器(如1-20ul移液器)

b）0.2ml,1.0ml和5.0ml移液器

c） 8或12道移液器（或移液装置）

d） 2个量筒（50ml）

e）1ml或5ml硅酸玻璃试管

f）96孔空板

g）实验室级水（双蒸水或去离子水）

h）配有405-410nm波长滤光片的96孔酶标仪

i）洗板机。

注意事项

A)、所有的试剂和样品都要视为生物安全材料处理。

B）、谨防试剂溅入皮肤和眼睛，一旦溅入，立即用凉水冲洗干净。

C）、洗液，对照血清，检测板，检测样品和其它检测试剂必须用漂白剂或强氧化剂作无害化处理。

D）、特别注意，所有试剂不要被血清和细菌污染。

E）、每块检查板都有湿度显示，如果显示出粉红色，板则需经处理；清理（漂白剂清洗）或无害化处理。

F）、过期的试剂盒不要使用。

G）、要想获得好的实验结果，必须遵守以下实验操作规则。

H）、不要用嘴对着吸管从试剂瓶中吸取试剂。

所有盒内的试剂需在2~7℃保存；开始实验前，所有检测试剂必须回温至室温（21℃-24℃）！

样品采集。

对于鸡群血清学的常规检测，建议每个鸡群固定时间（如每隔4周）进行检测，每次随机采集至少30份样品。要保证实验结果的可靠性，血清样品必须正确地采集、血清分离和保存（4℃多4天或-20℃长期保存）。

试剂盒待检血清稀释步骤

试剂	稀释用液体	稀释倍数	稀释方案	备   注
阳性对照血清	样品稀释液	1：100	5ul+495ul（1.5ml离心管稀释）	供三个孔用
阴性对照血清	样品稀释液	1：100	5ul+495ul（1.5ml离心管稀释）	供三个孔用
待检血清	样品稀释液	1：100	10ul+90ul；10ul+90ul
洗涤液	实验室用水	1：20	20ml+380ml	供一块板用
酶标抗体	样品稀释液	1：100	0.1ml+9.9ml	供一块板用
终止液	实验室用水	1：5	2.5ml+10ml	供一块板用

注意：5倍终止液保存时可能会产生白色固体，这并不影响产品质量。可以在室温或37℃下溶解后使用。

操作步骤

A）取出一块96孔待检样品稀释板（做好标记），每孔加入90ul血清样品稀释液，按图示1所示设置样品和对照的位置分别加入10ul阳性对照血清（+孔）、阴性对照血清（—孔）、待检血清（数字孔），充分混匀；室温平衡5分钟。（注意每个样品必须换吸头）

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	㈩	㈠	㈩	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)	(7)	(8)	(9)
B	(10)	(11)	(12)	(13)	(14)	(15)	(16)	(17)	(18)	(19)	(20)	(21)
C	(22)	(23)	(24)	(25)	(26)	(27)	(28)	(29)	(30)	(31)	(32)	(33)
D	(34)	(35)	(36)	(37)	(38)	(39)	(40)	(41)	(42)	(43)	(44)	(45)
E	(46)	(47)	(48)	(49)	(50)	(51)	(52)	(53)	(54)	(55)	(56)	(57)
F	(58)	(59)	(60)	(61)	(62)	(63)	(64)	(65)	(66)	(67)	(68)	(69)
G	(70)	(71)	(72)	(73)	(74)	(75)	(76)	(77)	(78)	(79)	(80)	(81)
H	(82)	83)	(84)	(85)	(86)	(87)	(88)	(89)	(90)	㈠	㈩	㈠

B）取出一块96孔NDV抗原包被板（做好标记），每孔加入90ul血清样品稀释液，从样品稀释版的每孔中吸出10ul加入到抗原包被板上对应孔（注意替换吸头，此步骤越快越好。），加完后振荡器充分混匀。

C） 室温孵育30分钟。，

洗板步骤

D）洗涤 倒出液体，每孔加入300ul洗液。浸泡2-3分钟，倒出洗液。再重复洗涤2次（洗涤是ELISA步骤中的关键步骤，请务必按照以上操作步骤进行）。

E） 加入100ul稀释的酶标抗体，

F） 室温孵育30分钟。

G）同上洗涤3次。

H） 加入100ul底物。

I）   室温孵育15分钟。

J） 加入100ul稀释过的终止液。

K） 在空气中读空白数。

L） 待泡沫消散后，在405-410nm的滤光片上测量和记录吸光值。

试验的有效性：

只有当阴性对照均值小于0.250，阳性对照平均值-阴性对照平均值在0.250-0.900之间，测定结果才有效；如果二者之一不在范围内，则测定结果无效，需重新检查；如果待检样品的SP值小于或等于0.150，则视其抗体滴度为0，或NDV抗体阴性。值的范围：阴性对照在0.060-0.080，阳性对照值在0.400-0.800，才能确保试验结果的一致性；请注意如果检查结果不在以上范围内，不能视检测结果无效。试验温度：70-75华氏度，既21-24℃。室温高可能导致OD值偏高。

 

结果处理

1.       阴性对照平均值=[A2(410)+H10(410)+H12(410)]/3

2.       阳性对照平均值=[A1(410)+A3(410)+H11(410)]/3

3.       SP值=（样品值-阴性对照平均值）/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)

抗体滴度的换算关系：Log10滴度=（1.464×log10SP）+3.740

例如：

1、 阳性对照值为：0.585，0.610，0.590，平均值为0.595

2、 阴性对照值为：0.078，0.067，0.057，平均值为0.067

3、 矫正值：0.595-0.067=0.528

4、 样品SP值的计算：比如样品的吸光值为0.560，SP=（0.560-0.067）/0.528=0.934

5、 样品滴度值的计算：

log10滴度=1.464 log0.934+3.740=3.70

滴度=Antilog3.70=4973

结果分析：

待检样品的NDV-ELISA抗体滴度值是在阴阳性对照值成立的前提下获得，同时也显示出了与其他鸡群的比较。因此，重要的是检测时阴阳性对照值的有效性，它的范围在本册子的上述有解释。

待检血清中出现NDV抗体滴度为0的样品，说明该样品相对NDV-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说没有明显的NDV特异性抗体。当检测样品的NDV抗体滴度值大于0时，表明待检样品中相对于对照来说有了含量较高的NDV抗体，但并不意味着能确保鸡群受到保护，也不能进行血清的分型。

理想的NDV的疫苗免疫程序和什么样的NDV抗体滴度水平对鸡群有保护性，是由试验操作者通过比较疫苗免疫前后NDV的ELISA抗体滴度水平（比如抗体滴度的变异系数和算数平均滴度）和鸡群的临床表现（发病率、死亡率、增重和体重的均一性）得出来的。