[禽病检测]传染性抗体检测IBV

Synbiotics传染性病毒抗体检测试剂盒(96-6506)

Infection Bronchitis Virus Antibody Test Kit (IB)

概述和用途

传染性（IB）是一种感染鸡群的高度接触性病毒性疾病，雏鸡感染本病主要表现为呼吸道症状和肾脏病变；蛋鸡感染主要表现为产蛋下降和蛋品质下降。

本试剂盒用于检测雏鸡母源抗体、在IBV疫苗免疫前后IB的抗体相对水平的检测，还可用于SPF鸡群IB抗体的监测。

原理

本试剂盒的设计用于检测鸡血清中传染性病毒（IBV）抗体相对水平。本试剂盒将传染性病毒（IBV）抗原包被微孔，待检血清加入包被微孔后的孵育阶段，血清中的特异性抗IB抗体和包被的IB抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物，洗涤液去除未反应的多余抗体，加入亲和纯化的过氧化物酶标记的酶标抗体，酶标抗体与吸附于包被抗原的抗体结合；孵育后，洗涤去除未结合的酶标抗体；加入酶底物显色。颜色反应与待检血清中IBV抗体的量直接相关。

90个待检样品所需试剂

a) 1块包被IB抗原的酶标板

b) 10μl IB阳性对照血清

c) 10μl 阴性对照血清

d) 100μl 羊抗鸡酶标二抗IgG酶标记

e) 40ml稀释液

f) 10ml 氢化ABTS 底物溶液

g) 2.5ml 5倍的终止液（使用前用实验室级水[1:5]稀释）

h)20ml 20倍的洗液（使用前用实验室级水[1:20]稀释）

注意：所有盒内的试剂需在2~7℃保存。

所需器材

a)      高精度移液器（如1~20μl移液器）

b)      0.2ml,1.0ml和5.0ml移液器

c)      8或12道移液器（或移液装置）

d)      2个量筒（50ml）

e)      1ml或5ml硅酸硼玻璃试管

f)        空96孔板

g)      实验室级水（双蒸水或去离子水）

h)      配有405-410nm波长滤光片的酶标仪

i)        洗板机

注意事项

a) 所有的试剂和样品都要视为生物安全材料处理。

b) 谨防试剂溅到眼睛和皮肤，一旦溅到，立即用凉水冲洗干净。

c） 洗液，对照血清，检测板，检测样品和其它检测试剂使用完后，必须用漂白剂或强氧化剂作无害化处理。

d） 特别注意，所有试剂不要被血清和细菌污染。

e） 每块检查板都有湿度显示，如果显示出粉红色，板则需经处理；清理（漂白剂清洗）或无害化处理。

f） 好的实验结果必须遵守以下实验操作规则，使用好的安全实验技术。

g） 过期的试剂盒不要使用。

h） 严禁用嘴对着吸管吸取任何检测试剂。

在开始实验前，所有的检测试剂必须回温至室温（21℃-24℃）！

 

样品采集

对于禽群血清学的常规检测，建议每个禽群固定时间（如每隔4周）进行检测。每次随机采集至少30份样品。为保证实验结果的可靠性，血清样品必须正确地采集、血清分离和保存（4℃多4天或-20℃长期保存）。

样品稀释步骤

血清样品必须在一个干净无包被抗原的96孔板中用样品稀释液稀释。按图示1所示设置样品和对照的位置。

图1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	㈩	㈠	㈩	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)	(7)	(8)	(9)
B	(10)	(11)	(12)	(13)	(14)	(15)	(16)	(17)	(18)	(19)	(20)	(21)
C	(22)	(23)	(24)	(25)	(26)	(27)	(28)	(29)	(30)	(31)	(32)	(33)
D	(34)	(35)	(36)	(37)	(38)	(39)	(40)	(41)	(42)	(43)	(44)	(45)
E	(46)	(47)	(48)	(49)	(50)	(51)	(52)	(53)	(54)	(55)	(56)	(57)
F	(58)	(59)	(60)	(61)	(62)	(63)	(64)	(65)	(66)	(67)	(68)	(69)
G	(70)	(71)	(72)	(73)	(74)	(75)	(76)	(77)	(78)	(79)	(80)	(81)
H	(82)	83)	(84)	(85)	(86)	(87)	(88)	(89)	(90)	㈠	㈩	㈠

血清稀释板的制备

a)      加入300μl稀释缓冲液到空板的每个微孔中，此板作为血清稀释板。

b)      按照图示1所示，加入6μl待检血清样品到每个样品孔（做一个1：50的稀释）。从A4开始到H9结束（从左到右，逐一添加）。例如，1到30孔包含禽群1的稀释血清，31到60孔包含禽群2的稀释血清，以此类推）。

c)      A2,H10和H12加入6μl阴性对照血清（相当于1：50稀释）。

d)      吸净A1，A3和H11孔中的所有液体。

e)      在进行IB检测前让所有稀释过的血清在缓冲液中平衡5分钟。

f)        稀释过的血清必须在24小时内检测。

此稀释板也可以用于其它抗体检测试剂盒（如REO，NDV，IBD和ILT）

IB阳性对照的制备

本试剂盒中提供一瓶IB阳性对照血清。在一个干净的玻璃试管中用稀释缓冲液1：50稀释。例如，用6μl阳性对照血清加300μl稀释缓冲液。充分混合均匀。每块板至少需要150μlIB阳性对照。

酶标记物溶液的制备

100μl酶标记物加10毫升稀释缓冲液（1：100稀释）。混合均匀。足够一块板使用。

一倍洗液的制备

用20毫升浓缩洗液加380毫升实验室级水（1：20）。混合均匀。足够一块酶标板使用

底物溶液的制备

底物溶液随用随配。每块板需要10毫升。为达到结果，底物溶液在使用前需要回温至室温。

一倍终止液的制备

用2.5毫升浓缩的终止液加10毫升实验室级水（1：5）稀释。混合均匀。足够1块酶标板使用。

注意：5倍终止液冷藏保存时可能会产生白色固体，这并不影响产品质量。可以在室温或37℃下溶解后使用。

ELISA检测步骤

酶标板的准备

a)      取出一块板

b)      在每个孔中加入50μl稀释缓冲液

c)      加入50μlIB阳性对照血清到A1,A3,H11孔。更换吸头

d)      用多道枪从血清板上移取50μl每孔的液体至酶标板。注意替换吸头。此步骤越快越好。

e)      室温孵育30分钟。

洗板步骤

f)        倒出液体到废液槽；

g)      使用多道枪加入300μl洗液。允许浸泡3分钟，倒出洗液，在吸水纸上拍板，确保无残留。再重复以上步骤两次。

注意事项：

洗涤是ELISA步骤中的关键步骤，请务必按照以上操作步骤进行。

加入酶标抗体、底物和停止液

h)      用多道枪加入100μl稀释过的酶标抗体到每个孔。更换吸头；

i)        室温孵育30分钟；

j)        洗板三次，见f-g步骤；

k)      用多道枪加入100μl底物到每个孔。更换吸头；

l)        室温孵育15分钟

m)    用排枪加入100μl稀释过的停止液到每个孔。

n)      读板前等泡沫消散

结果处理

a)      用酶标仪在405~410nm波长下读板。

b)      计算并记录阳性对照OD值的平均值（A1、A3和H11），阴性对照的OD值的平均值（A2、H10和H12）。

c)      阳性对照的平均值减去阴性对照的平均值，得到阳性对照校正值。

d)      计算样品的SP值，样品的OD值减去阴性对照值的平均值，再除以阳性对照校正值。SP=（样品值-阴性对照平均值）/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)

e)      抗体滴度的换算关系：

Log₁₀滴度=（1.642×log₁₀SP）+3.568

滴度=LOG₁₀滴度的反LOG值

例如：

1、 阳性对照值为：0.585，0.610，0.590，平均值为0.595

2、 阴性对照值为：0.110，0.102，0.112，平均值为0.108

3、 阳性对照校正值：0.595-0.108=0.487

4、 样品SP值的计算：比如样品的吸光值为0.560，SP=（0.560-0.108）/0.487=0.928

5、 样品滴度值的计算：

log₁₀滴度=1.642log₁₀0.934+3.568=3.51

滴度=反log3.43=3271

结果

实验的有效性：

只有当阴性对照均值小于0.250，阳性对照校正值在0.250-0.900之间，测定结果才有效；如果二者中任何一个不在范围内，则测定结果无效，需重新检测；如果待检样品的SP值小于或等于0.150，则视其抗体滴度为0，或IB抗体阴性。

值的范围：阴性对照在0.080-0.150，阳性对照值在0.400-0.850，才能确保实验结果的一致性；请注意如果检查结果不在以上范围内，不等同于检测结果无效。

实验温度：70-75华氏度，即21-24℃。室温高可能导致OD值偏高。

结果分析：

待检样品的IB-ELISA抗体滴度值说明了每个禽群的检测血清和阴阳性对照值的比较。因此，首先确定阴阳性对照值的有效性是至关重要的。

待检血清中出现IB抗体滴度为0的样品，说明该样品相对IB-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说没有明显的IB特异性抗体。检测中，非特异的吸光值差异较大，当高于0.250时，可能会影响检测的敏感性。当鸡群感染IBV之外的其他病原体时，会影响IBV油乳剂灭活苗的免疫性效果，出现低水平的抗IBV抗体滴度（小于600）。

待检血清中出现IB抗体滴度大于0的样品，说明该样品相对IB-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说有明显的IB特异性抗体。然而，我们不知道该IB抗体水平对鸡群是否有保护性，也分辨不出该IB抗体是由疫苗免疫产生的还是野毒感染所致。

理想的IB的疫苗免疫程序和什么样的IB抗体滴度水平对鸡群有保护性，是由实验操作者通过比较疫苗免疫前后IB的ELISA抗体滴度水平（比如抗体滴度的变异系数和算数平均滴度）和鸡群的临床表现（发病率、死亡率、增重和体重的均一性）得出来的。