[禽病诊断]禽呼肠孤病毒抗体检测REO

禽呼肠孤病毒抗体检测试剂盒（96-6512）

Avian Reovirus Antibody Test Kit(REO)

概述和用途

临床上发生关节炎（腱鞘炎），和生长迟缓的病鸡分离出呼肠孤病毒。鸡和火鸡易感，感染呼肠孤病毒后易发生病毒性关节炎。5-7w的肉鸡易发病，但大日龄的鸡偶尔也发病。感染禽将发生滑膜炎和腱鞘炎。Snyder和他的同事建立了ELISA方法检测REOV特异性抗体。

ProFLOK牌REO-ELISA检测试剂盒能够快速检测鸡血清样品中的特异性的REO抗体，该方法主要用于检测鸡在REO疫苗免疫前后REO抗体情况。

原理

本实验设计用包被的REO抗原结合并检测REO抗体相对水平。主要原理如下：将呼肠孤病毒（REOV）抗原包被微孔，加入用血清稀释液稀释感染REOV抗原具有特异性抗REO抗体的鸡血清，形成抗原和抗体复合物，洗涤液去除多余的未反应抗体，加入亲和纯化的过氧化物标记的羊抗鸡IgG， 洗涤后再加入二铵盐ABTS底物显色15分钟，加入终止液终止反应，在酶标仪上用波长405-410nm的滤光片读取OD值。

90个待检样品所需试剂

a) 1块包被REO抗原的酶标板

b) 10μl REO阳性对照血清

c) 10ul 阴性对照血清

d) 100μl 羊抗鸡酶标二抗IgG酶标记

e) 40ml稀释液

f) 10ml 氢化ABTS 底物溶液

g) 2.5ml 5倍的终止液（使用前用实验室级水[1:5]稀释）

h)20ml 20倍的洗液（使用前用实验室级水[1:20]稀释）

注意：所有盒内的试剂需在2~7℃保存。

所需器材

a)      高精度移液器（如1~20ul移液器）

b)      0.2ml,1.0ml和5.0ml移液器

c)      8或12道移液器（或移液装置）

d)      2个量筒（50ml）

e)      1ml或5ml硅酸硼玻璃试管

f)        空96孔板

g)      实验室级水（双蒸水或去离子水）

h)      配有405-410nm波长滤光片的酶标仪

i)        洗板机

注意事项

a) 所有的试剂和样品都要视为生物安全材料处理。

b) 谨防试剂溅到眼睛和皮肤，一旦溅到，立即用凉水冲洗干净。

c） 洗液，对照血清，检测板，检测样品和其它检测试剂必须用漂白剂或强氧化剂作无害化处理。

d） 特别注意，所有试剂不要被血清和细菌污染。

e） 每块检查板都有湿度显示，如果显示出粉红色，板则需经处理；清理（漂白剂清洗）或无害化处理。

f） 好的实验结果必须遵守以下实验操作规则，使用好的安全实验技术。

g） 过期的试剂盒不要使用。

h) 严禁用嘴吸取

在开始实验前，所有的检测试剂必须回温至室温（21℃-24℃）！

样品采集。

对于鸡群血清学的常规检测，建议每个鸡群固定时间（如每隔4周）进行检测。为保证实验结果的可靠性，每次随机采集至少30份样品；血清样品必须正确地采集、血清分离和保存（4℃多4天或-20℃长期保存）。

样品稀释步骤

血清样品必须在一个干净无包被抗原的96孔板中用样品稀释液稀释。按图示1所示设置样品和对照的位置。图1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	㈩	㈠	㈩	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)	(7)	(8)	(9)
B	(10)	(11)	(12)	(13)	(14)	(15)	(16)	(17)	(18)	(19)	(20)	(21)
C	(22)	(23)	(24)	(25)	(26)	(27)	(28)	(29)	(30)	(31)	(32)	(33)
D	(34)	(35)	(36)	(37)	(38)	(39)	(40)	(41)	(42)	(43)	(44)	(45)
E	(46)	(47)	(48)	(49)	(50)	(51)	(52)	(53)	(54)	(55)	(56)	(57)
F	(58)	(59)	(60)	(61)	(62)	(63)	(64)	(65)	(66)	(67)	(68)	(69)
G	(70)	(71)	(72)	(73)	(74)	(75)	(76)	(77)	(78)	(79)	(80)	(81)
H	(82)	83)	(84)	(85)	(86)	(87)	(88)	(89)	(90)	㈠	㈩	㈠

血清稀释板的制备

a)      加入300ul稀释缓冲液到空板的每个微孔中，此板作为血清稀释板。

b)      按照图示1所示，加入6ul待检血清样品到每个样品孔（做一个1：50的稀释）。从A4开始到H9结束（从左到右，逐一添加）。例如，1到30孔包含禽群1的稀释血清，31到60孔包含禽群2的稀释血清，以此类推）。

c)      A2,H10和H12加入6ul阴性对照血清（相当于1：50稀释）。

d)      吸净A1，A3和H11孔中的所有液体，

e)      在进行REO检测前让所有稀释过的血清在缓冲液中平衡5分钟

f)        稀释过的血清必须在24小时内检查。

此稀释板也可以用于其它抗体检测试剂盒（如IBD,NDV,IBV和ILT）

REO阳性对照的制备

本试剂盒中提供一瓶REO阳性对照血清。在一个干净的玻璃试管中用稀释缓冲液1：50稀释。例如，用6ul阳性对照血清加300ul稀释缓冲液。混合均匀。每块板至少需要150ul阳性对照。

酶标记物溶液的制备

100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG酶标二抗加10毫升稀释缓冲液（1：100稀释）。混合均匀。足够一块板使用。

一倍洗液的制备

用20毫升浓缩洗液加380毫升实验室级水（1：20）。混合均匀。足够一块酶标板使用

底物溶液的制备

底物溶液即开即用。每块板需要10毫升。为达到结果，底物溶液在使用前需要回温至室温。

一倍终止液的制备

用2.5毫升浓缩的终止液加10毫升实验室级水（1：5）稀释。混合均匀。足够1块酶标板使用。

注意：5倍终止液保存时可能会产生白色固体，这并不影响产品质量。可以在室温或37℃下溶解后使用。

ELISA检测步骤

酶标板的准备

a)      取出一块板

b)      在每个孔中加入50ul稀释缓冲液

c)      加入50ulREO阳性对照血清到A1,A3,H11孔。更换吸头

d)      用多道枪从血清板上移取50ul每孔的液体至酶标板。注意替换吸头。此步骤越快越好。

e)      室温孵育30分钟。

洗板步骤

f)        倒出液体

g)      使用多道枪加入300ul洗液。允许浸泡3分钟，倒出洗液至废液槽（内含净化溶液），在吸水纸上拍板确保无残留。再重复以上步骤两次。

注意事项：

洗涤是ELISA步骤中的关键步骤，请务必按照以上操作步骤进行。

加入酶标底物和终止液

h)      用移液枪加入100ul稀释过的酶标到每个孔。更换吸头

i)        室温孵育30分钟

j)        洗板三次

k)      用移液枪加入100ul底物到每个孔。更换吸头

l)        室温孵育15分钟

m)    用移液枪加入100ul稀释过的终止液到每个孔。

n)      读板前等泡沫消散

结果处理

a)      用酶标仪在405~410nm波长下读板。设置空白为对照。

b)      计算并记录阳性质控OD值的平均值（A1、A3和H11），阴性对照的OD值的平均值（A2、H10和H12）。

c)      阳性质控的平均值减去阴性对照的平均值，得到阳性对照平均值的修正阳性对照值。

d)      计算样品的SP值，样品的OD值减去阴性对照值的平均值，再除以阴、阳性对照平均值之差。SP=（样品值-阴性对照平均值）/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)

e)      抗体滴度的换算关系：

LOG₁₀滴度=（1.077×LOG₁₀SP）+3.460

滴度=LOG₁₀滴度的反LOG值

例如：

1、 阳性对照值为：0.585，0.610，0.590，平均值为0.595

2、 阴性对照值为：0.078，0.067，0.057，平均值为0.067

3、 修正阳性对照值：0.595-0.067=0.528

4、 样品SP值的计算：比如样品的吸光值为0.560，SP=（0.560-0.067）/0.528=0.934

5、 样品滴度值的计算：

log10滴度=1.077log0.934+3.460=3.43

滴度=反log3.43=2680

结果

试验的有效性：

只有当阴性对照均值小于0.250，阳性对照值均值再0.250-0.900之间，测定结果才有效；如果二者之一不在范围内，则测定结果无效，需重新检查；如果待检样品的SP值小于或等于0.150，则视其抗体滴度为0，或REO抗体阴性。值的范围：阴性对照在0.060-0.080，阳性对照值在0.400-0.800，才能确保试验结果的一致性；请注意如果检查结果不在以上范围内，不能视检测结果无效。试验温度：70-75华氏度，既21-24℃。室温高可能导致OD值偏高。

结果分析：

待检样品的REO-ELISA抗体滴度值是在阴阳性对照值成立的前提下获得，同时也显示出了与其他鸡群的比较。因此，重要的是检测时阴阳性对照值的有效性，它的范围在本册子的上述有解释。

待检血清中出现REO抗体滴度为0的样品，说明该样品相对REO-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说没有明显的REO特异性抗体。

待检血清中出现REO抗体滴度大于0的样品，说明该样品相对REO-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说有明显的REO特异性抗体。然而，我们不知道该REO抗体水平对鸡群是否有保护性，也分辨不出该REO抗体是由疫苗免疫产生的还是野毒感染所致。

理想的REO的疫苗免疫程序和什么样的REO抗体滴度水平对鸡群有保护性，是由试验操作者通过比较疫苗免疫前后REO的ELISA抗体滴度水平（比如抗体滴度的变异系数和算数平均滴度）和鸡群的临床表现（发病率、死亡率、增重和体重的均一性）得出来的。

中文说明书

禽呼肠孤病毒抗体检测试剂盒

Avian Reovirus Antibody Test Kit(REO)

概述和用途

临床上发生关节炎（腱鞘炎），和生长迟缓的病鸡分离出呼肠孤病毒。鸡和火鸡易感，感染呼肠孤病毒后易发生病毒性关节炎。5-7w的肉鸡易发病，但大日龄的鸡偶尔也发病。感染禽将发生滑膜炎和腱鞘炎。Snyder和他的同事建立了ELISA方法检测REOV特异性抗体。

本试剂盒用于检测雏鸡母源抗体、在REOV疫苗免疫前后REO的抗体相对水平的检测，还可用于SPF鸡群REOV抗体的监测。

原理

本试剂盒的设计用于检测鸡血清中禽呼肠孤病毒（REOV）抗体相对水平。本试剂盒将禽呼肠孤病毒（REOV）抗原包被微孔，待检血清加入包被微孔后的孵育阶段，血清中的特异性抗REO抗体和包被的REOV抗原发生反应，形成抗原-抗体复合物，洗涤液去除未反应的多余抗体，加入亲和纯化的过氧化物酶标记的酶标抗体，酶标抗体与吸附于包被抗原的抗体结合；孵育后，洗涤去除未结合的酶标抗体；加入酶底物显色。颜色反应与待检血清中REOV抗体的量直接相关。

匹配试剂

1. 禽呼肠孤病毒（REOV）包被板                                    5块

2. 待检血清稀释板（可用于IBD,NDV,IBV和ILT）                          5块

3. 含REOV抗体阳性对照血清（稀释待用，足够量）                         1瓶

4. 不含REOV抗体阳性对照血清（稀释待用，足够量）                       1瓶

5. 酶标抗体，山羊抗鸡酶标二抗IgG酶标记物（稀释待用，足够量）           1瓶

6. 氢化二铵盐底物ABTS（100ml）                                         1瓶

7. 终止液（稀释待用，25ml）                                            1瓶

8. 洗涤液（稀释待用，100ml）                                           1瓶

9. 样品稀释液（200ml）                                                 1瓶

所需器材

高精度移液器，0.2ml,1.0ml和5.0ml移液器，多道移液器，吸头，量筒，玻璃试管，实验室级水（双蒸水或去离子水），配有405-410nm波长滤光片的96孔酶标仪，洗板机。

注意事项

A)、所有的试剂和样品都要视为生物安全材料处理。

B）、谨防试剂溅入皮肤和眼睛，一旦溅入，立即用凉水冲洗干净。

C）、洗液，对照血清，检测板，检测样品和其它检测试剂必须用漂白剂或强氧化剂作无害化处理。

D）、特别注意，所有试剂不要被血清和细菌污染。

E）、每块检查板都有湿度显示，如果显示出粉红色，板则需经处理；清理（漂白剂清洗）或无害化处理。

F）、过期的试剂盒不要使用。

G）、好想获得好的实验结果，必须遵守以下实验操作规则。

所有盒内的试剂需在2~7℃保存；开始实验前，所有检测试剂必须回温至室温（21℃-24℃）！

样品采集。

对于鸡群血清学的常规检测，建议每个鸡群固定时间（如每隔4周）进行检测，每次随机采集至少30份样品。要保证实验结果的可靠性，血清样品必须正确地采集、血清分离和保存（4℃多4天或-20℃长期保存）。

样品稀释步骤

试剂	稀释用液体	稀释倍数	稀释方案	备   注
阳性对照血清	样品稀释液	1：100	10ul+90ul；10ul+90ul
阴性对照血清	样品稀释液	1：100	10ul+90ul；10ul+90ul
待检血清	样品稀释液	1：100	10ul+90ul；10ul+90ul
洗涤液	实验室用水	1：20	20ml+380ml	一块板用
酶标抗体	样品稀释液	1：100	0.1ml+9.9ml	一块板用
终止液	实验室用水	1：5	2.5ml+10ml	一块板用

注意：5倍终止液保存时可能会产生白色固体，这并不影响产品质量。可以在室温或37℃下溶解后使用。

操作步骤

A）取出一块96孔待检样品稀释板（做好标记），每孔加入90ul血清样品稀释液，按图示1所示设置样品和对照的位置分别加入10ul阳性对照血清（+孔）、阴性对照血清（—孔）、待检血清（数字孔），充分混匀；室温平衡5分钟。（注意每个样品必须换吸头）

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	㈩	㈠	㈩	(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)	(7)	(8)	(9)
B	(10)	(11)	(12)	(13)	(14)	(15)	(16)	(17)	(18)	(19)	(20)	(21)
C	(22)	(23)	(24)	(25)	(26)	(27)	(28)	(29)	(30)	(31)	(32)	(33)
D	(34)	(35)	(36)	(37)	(38)	(39)	(40)	(41)	(42)	(43)	(44)	(45)
E	(46)	(47)	(48)	(49)	(50)	(51)	(52)	(53)	(54)	(55)	(56)	(57)
F	(58)	(59)	(60)	(61)	(62)	(63)	(64)	(65)	(66)	(67)	(68)	(69)
G	(70)	(71)	(72)	(73)	(74)	(75)	(76)	(77)	(78)	(79)	(80)	(81)
H	(82)	83)	(84)	(85)	(86)	(87)	(88)	(89)	(90)	㈠	㈩	㈠

B）取出一块96孔REOV抗原包被板（做好标记），每孔加入90ul血清样品稀释液，从样品稀释版的每孔中吸出10ul加入到抗原包被板上对应孔（注意替换吸头，此步骤越快越好。），加完后振荡器充分混匀。

C）室温孵育30分钟。，

洗板步骤

D）洗涤 倒出液体，每孔加入300ul洗液。浸泡2-3分钟，倒出洗液。再重复洗涤2次（洗涤是ELISA步骤中的关键步骤，请务必按照以上操作步骤进行）。

E） 加入100ul稀释的酶标抗体，

F） 室温孵育30分钟。

G） 同上洗涤3次。

H） 加入100ul底物。

I）    室温孵育15分钟。

J） 加入100ul稀释过的终止液。

K） 在空气中读空白数。

L） 待泡沫消散后，在405-410nm的滤光片上测量和记录吸光值。

试验的有效性：

只有当阴性对照均值小于0.250，阳性对照值均值再0.250-0.900之间，测定结果才有效；如果二者之一不在范围内，则测定结果无效，需重新检查；如果待检样品的SP值小于或等于0.150，则视其抗体滴度为0，或REO抗体阴性。值的范围：阴性对照在0.060-0.080，阳性对照值在0.400-0.800，才能确保试验结果的一致性；请注意如果检查结果不在以上范围内，不能视检测结果无效。试验温度：70-75华氏度，既21-24℃。室温高可能导致OD值偏高。

 

结果处理

1.      阴性对照平均值=[A2(410)+H10(410)+H12(410)]/3

2.      阳性对照平均值=[A1(410)+A3(410)+H11(410)]/3

3.      SP值=（样品值-阴性对照平均值）/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)

抗体滴度的换算关系：Log10滴度=（1.172×log10SP）+3.614

例如：

6、 阳性对照值为：0.585，0.610，0.590，平均值为0.595

7、 阴性对照值为：0.078，0.067，0.057，平均值为0.067

8、 修正阳性对照值：0.595-0.067=0.528

9、 样品SP值的计算：比如样品的吸光值为0.560，SP=（0.560-0.067）/0.528=0.934

10、             样品滴度值的计算：

log10滴度=1.0772log0.934+3.460=3.43

滴度=Antilog3.43=2680

结果分析：

待检样品的REO-ELISA抗体滴度值是在阴阳性对照值成立的前提下获得，同时也显示出了与其他鸡群的比较。因此，重要的是检测时阴阳性对照值的有效性，它的范围在本册子的上述有解释。

待检血清中出现REO抗体滴度为0的样品，说明该样品相对REO-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说没有明显的REO特异性抗体。

待检血清中出现REO抗体滴度大于0的样品，说明该样品相对REO-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说有明显的REO特异性抗体。然而，我们不知道该REO抗体水平对鸡群是否有保护性，也分辨不出该REO抗体是由疫苗免疫产生的还是野毒感染所致。

理想的REO的疫苗免疫程序和什么样的REO抗体滴度水平对鸡群有保护性，是由试验操作者通过比较疫苗免疫前后REO的ELISA抗体滴度水平（比如抗体滴度的变异系数和算数平均滴度）和鸡群的临床表现（发病率、死亡率、增重和体重的均一性）得出来的。