鸡传染性病的抗体检测试剂盒
Chicken anemia Virus AntCAVody Test Kit(CAV)
概述和用途
鸡传染性病病毒(CAV)是一种能导致雏鸡严重的免疫抑制的病原体。该病毒通常在1-5周龄的雏鸡群中水平传播;也能通过感染鸡群的粪便垂直传播。垂直传播的鸡群通常能导致2-3周龄的雏鸡群高达60%以上的死亡率。CAV能导致易感鸡群发生明显的再生障碍性、皮下和肌肉出血、骨髓发育不良、坏疽性皮炎和所有的淋巴器官萎缩。
鸡传染性病病毒感染通常用病原分离和用酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接免疫荧光实验(IFA)或病毒中和试验(VN)检测血清中CAV抗体等血清学方法来进行诊断。IFA和VN实验需要将病毒进行传代,使大量的血清学实验变得更加繁琐;而ELISA方法不需要病毒传代,相对于其他的方法具有几个明显的优点。ELISA方法是自动化系统设计,不需要借助于显微镜检查,就能比IFA普遍敏感。这些优点使得ELISA方法更加适合大量的血清样品检测,以及鸡群的CAV的血清流行病学的调查。
本试剂盒适用于雏鸡CAV母源抗体的检测和SPF鸡群CAV抗体的监测。
原理
本试剂盒的设计用于检测鸡血清中鸡传染性病病毒(CAV)抗体相对水平。本试剂盒将鸡传染性病病毒(CAV)抗原包被微孔,待检血清加入包被微孔后的孵育阶段,血清中的特异性抗CAV抗体和包被的CAV抗原发生反应,形成抗原-抗体复合物,洗涤液去除未反应的多余抗体,加入亲和纯化的过氧化物酶标记的酶标抗体,酶标抗体与吸附于包被抗原的抗体结合;孵育后,洗涤去除未结合的酶标抗体;加入酶底物显色。颜色反应与待检血清中CAV抗体的量直接相关。
90个待检样品所需试剂
A)1块包被CAV抗原的酶标板
B)10ulCAV阳性对照血清
C)10ul阴性对照血清
D)100ul山羊抗鸡酶标二抗IgG(H+L)酶标记物
E)40ml样品稀释液
F)10ml氢化ABTS底物溶液
G)2.3ml 5倍浓缩的终止液,用含有5%的SDS的二蒸水或去离子水作1:5稀释
H)15ml 20倍浓缩的洗涤液,用二蒸水或去离子水作1:20倍稀释。
注意:所有的试剂必须在2-7℃保存,不能冻存。
所需器材
a) 高精度移液器(如1-20ul移液器)
b)0.2ml,1.0ml和5.0ml移液器
c) 8或12道移液器(或移液装置)
d) 2个量筒(50ml)
e)1ml或5ml硅酸玻璃试管
f)96孔空板
g)实验室级水(双蒸水或去离子水)
h)配有405-410nm波长滤光片的96孔酶标仪
i)洗板机。
注意事项
A)、所有的试剂和样品都要视为生物安全材料处理。
B)、谨防试剂溅入皮肤和眼睛,一旦溅入,立即用凉水冲洗干净。
C)、洗液,对照血清,检测板,检测样品和其它检测试剂必须用漂白剂或强氧化剂作无害化处理。
D)、特别注意,所有试剂不要被血清和细菌污染。
E)、每块检查板都有湿度显示,如果显示出粉红色,板则需经处理;清理(漂白剂清洗)或无害化处理。
F)、过期的试剂盒不要使用。
G)、好想获得好的实验结果,必须遵守以下实验操作规则。
所有盒内的试剂需在2~7℃保存;开始实验前,所有检测试剂必须回温至室温(21℃-24℃)!
样品采集。
对于鸡群血清学的常规检测,建议每个鸡群固定时间(如每隔4周)进行检测,每次随机采集至少30份样品。要保证实验结果的可靠性,血清样品必须正确地采集、血清分离和保存(4℃多4天或-20℃长期保存)。
试剂盒待检血清稀释步骤
试剂 |
稀释用液体 |
稀释倍数 |
稀释方案 |
备 注 |
阳性对照血清 |
样品稀释液 |
1:100 |
10ul+90ul;10ul+90ul |
|
阴性对照血清 |
样品稀释液 |
1:100 |
10ul+90ul;10ul+90ul |
|
待检血清 |
样品稀释液 |
1:100 |
10ul+90ul;10ul+90ul |
|
洗涤液 |
实验室用水 |
1:20 |
20ml+380ml |
一块板用 |
酶标抗体 |
样品稀释液 |
1:100 |
0.1ml+9.9ml |
一块板用 |
终止液 |
实验室用水 |
1:5 |
2.5ml+10ml |
一块板用 |
注意:5倍终止液保存时可能会产生白色固体,这并不影响产品质量。可以在室温或37℃下溶解后使用。
操作步骤
A)取出一块96孔待检样品稀释板(做好标记),每孔加入90ul血清样品稀释液,按图示1所示设置样品和对照的位置分别加入10ul阳性对照血清(+孔)、阴性对照血清(—孔)、待检血清(数字孔),充分混匀;室温平衡5分钟。(注意每个样品必须换吸头)
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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A |
㈩ |
㈠ |
㈩ |
(1) |
(2) |
(3) |
(4) |
(5) |
(6) |
(7) |
(8) |
(9) |
B |
(10) |
(11) |
(12) |
(13) |
(14) |
(15) |
(16) |
(17) |
(18) |
(19) |
(20) |
(21) |
C |
(22) |
(23) |
(24) |
(25) |
(26) |
(27) |
(28) |
(29) |
(30) |
(31) |
(32) |
(33) |
D |
(34) |
(35) |
(36) |
(37) |
(38) |
(39) |
(40) |
(41) |
(42) |
(43) |
(44) |
(45) |
E |
(46) |
(47) |
(48) |
(49) |
(50) |
(51) |
(52) |
(53) |
(54) |
(55) |
(56) |
(57) |
F |
(58) |
(59) |
(60) |
(61) |
(62) |
(63) |
(64) |
(65) |
(66) |
(67) |
(68) |
(69) |
G |
(70) |
(71) |
(72) |
(73) |
(74) |
(75) |
(76) |
(77) |
(78) |
(79) |
(80) |
(81) |
H |
(82) |
83) |
(84) |
(85) |
(86) |
(87) |
(88) |
(89) |
(90) |
㈠ |
㈩ |
㈠ |
B)取出一块96孔CAVV抗原包被板(做好标记),每孔加入90ul血清样品稀释液,从样品稀释版的每孔中吸出10ul加入到抗原包被板上对应孔(注意替换吸头,此步骤越快越好。),加完后振荡器充分混匀。
C) 室温孵育30分钟。,
洗板步骤
D)洗涤 倒出液体,每孔加入300ul洗液。浸泡2-3分钟,倒出洗液。再重复洗涤2次(洗涤是ELISA步骤中的关键步骤,请务必按照以上操作步骤进行)。
E) 加入100ul稀释的酶标抗体,
F) 室温孵育30分钟。
G)同上洗涤3次。
H) 加入100ul底物。
I) 室温孵育15分钟。
J) 加入100ul稀释过的终止液。
K) 在空气中读空白数。
L) 待泡沫消散后,在405-410nm的滤光片上测量和记录吸光值。
试验的有效性:
只有当阴性对照均值小于0.200,阳性对照值均值再0.250-0.900之间,测定结果才有效;如果二者之一不在范围内,则测定结果无效,需重新检查;如果待检样品的SP值小于或等于0.410,则视其抗体滴度为0,或CAV抗体阴性。值的范围:阴性对照在0.075-0.150,阳性对照值在0.400-1.00,才能确保试验结果的一致性;请注意如果检查结果不在以上范围内,不能视检测结果无效。试验温度:70-75华氏度,即21-24℃。室温高可能导致OD值偏高。
结果处理
1. 阴性对照平均值=[A2(410)+H10(410)+H12(410)]/3
2. 阳性对照平均值=[A1(410)+A3(410)+H11(410)]/3
3. SP值=(样品值-阴性对照平均值)/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)
抗体滴度的换算关系:Log10滴度=(1.009×log10SP)+3.628
例如:
1、 阳性对照值为:0.585,0.610,0.590,平均值为0.595
2、 阴性对照值为:0.078,0.067,0.057,平均值为0.067
3、 矫正值:0.595-0.067=0.528
4、 样品SP值的计算:比如样品的吸光值为0.560,SP=(0.560-0.067)/0.528=0.934
5、 样品滴度值的计算:
log10滴度=1.009log0.934+3.628=3.598
滴度=Antilog3.43=3964
结果分析:
待检样品的CAV-ELISA抗体滴度值是在阴阳性对照值成立的前提下获得,同时也显示出了与其他鸡群的比较。因此,重要的是检测时阴阳性对照值的有效性,它的范围在本册子的上述有解释。
待检血清中出现CAV抗体滴度为0的样品,说明该样品相对CAV-ELISA试剂盒的阴阳性对照来说没有明显的CAV特异性抗体。当检测样品的CAV抗体滴度值大于0时,表明待检样品中相对于对照来说有了含量较高的CAV抗体,但并不意味着能确保鸡群受到保护,也不能进行血清的分型。
理想的CAV的疫苗免疫程序和什么样的CAV抗体滴度水平对鸡群有保护性,是由试验操作者通过比较疫苗免疫前后CAV的ELISA抗体滴度水平(比如抗体滴度的变异系数和算数平均滴度)和鸡群的临床表现(发病率、死亡率、增重和体重的均一性)得出来的。