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AsurDxTM Senecavirus A (SVA) Antibody Test Kit
一、概述
试剂盒用于检测猪血清或者血浆中Senecavirus A A (SVA)抗体。试剂盒原理是基于间接ELISA方法，酶标板上已经包被SVA蛋白重组抗原，添加样品后，样品内的抗体能与板上包被抗原特异性结合形成抗原抗体复合物，并与后面加入的酶标二抗结合，二抗上的酶再催化底物显色，显色深度与样品中的抗体含量成正相关。
二、试剂盒规格及组分
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试剂盒组分 |
10039-02 |
10039-05 |
储存温度 |
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抗原包被板SVA antigen-Coated Plate |
2*96 |
5*96 |
4°C |
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阳性对照（红盖） Positive Control |
2管 |
5管 |
4°C |
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阴性对照（白盖） Negative Control |
0.2mL |
0.5mL |
4°C |
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酶标二抗HRP-Conjugated Antibody Solution |
24mL |
58mL |
4°C |
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10X稀释液10X Diluent Solution |
12mL |
28mL |
4°C |
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检测稀释液 Assay Diluent |
20mL |
50mL |
4°C |
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20X洗板液 20X Wash Solution |
56mL |
120mL |
4°C |
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TMB底物 TMB Substrate |
24mL |
58mL |
4°C |
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终止液 Stop Solution |
24mL |
58mL |
4°C |
备注：如果试剂盒超过一个月不使用建议阴阳性对照和酶标二抗-20°C储存。
三、试剂以及样品制备
1X稀释液：用9体积的蒸馏水稀释1体积的10X稀释液，得到1X稀释液。
1X洗板液：用19体积的蒸馏水稀释1体积的20X洗板液，得到1X洗板液。
样品血清/血浆预稀释：在血清稀释板上使用1X稀释液将样品血清稀释10倍，例如将20uL的血清加入到180uL的1X稀释液中混匀，备用。
阳性对照：取出回温30分钟后，每管加入65ul 1X稀释液，振荡混匀后备用，不使用时放于-20°C储存，反复冻融应不多于3次。
四、实验操作
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试剂 |
每孔用量 |
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检测稀释液 |
90 ul |
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样品/对照 |
10 ul |
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酶标二抗 |
100 ul |
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1X洗板液 |
2 ml |
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底物 |
100 ul |
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终止液 |
100 ul |
1. 实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出回复室温；
2. 设置好对照及样品在抗原包被板的位置，所有孔中加入90ul 检测稀释液；
3. 加入10ul的阳性对照到抗原包被板两个孔中；
4. 加入10ul的阴性对照到抗原包被板的另外两个孔中；（强烈建议将阴性和阳性对照血清分隔加入，例如左上方加阳性对照，右下方加阴性对照）
5. 其他孔加入10ul预稀释的血清样品（已经预稀释了1:10）.
6. 轻微振荡1分钟；
7. 封板，25°C孵育45分钟；（注意避免阳光直射和空气进入板中）
8. 弃去板中的液体；
9. 每孔加入250ul洗涤液洗板5次，然后一次请把板孔拍干；
10. 每孔加入100uL酶标二抗，封板，25°C暗处孵育30分钟；
11. 每孔加入250ul洗涤液洗板3次，然后一次请把板孔拍干；
12. 每孔加入100uL的TMB底物，室温下暗处孵育20分钟；
13. 每孔加入100uL终止液，然后酶标仪450nm读数；
五、结果判断
样品PP值=（样品OD值÷阳性对照OD值）*100
有效性：阴性对照的PP值必须小于40%，阳性对照OD值的平均值必须≥0.7
阴性：样品的PP值小于40%，样品血清中抗体阴性
阳性：样品的PP值大于40%，样品血清中抗体阳性
六、问题与解决
1.标准品无颜色变化或者无相应数值
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可能原因 |
解决方法 |
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试剂使用顺序混乱，或者操作步骤出错。 |
遵循实验说明重复实验。 |
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使用了失效的酶标抗原， |
确保酶标抗原来自同一试剂盒，同一批次 |
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TMB底物失效。 |
使用新的TMB底物。 |
2.低吸光度（OD值）
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可能原因 |
解决方法 |
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试剂过期，或者不同的批次混用。 |
查证过期试剂和批次。 |
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洗液配制错误。 |
使用试剂盒提供的洗液，正确配制。 |
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过多次洗涤。 |
按照说明书要求进行洗涤。 |
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孵育时间过短。 |
按照说明书要求，严格计算好时间。 |
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实验室温度过低。 |
保持实验室温度在（22.5±2.5）°C不要在空调风口或者寒冷的窗户旁进行实验。 |
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试剂或者微孔板温度过低。 |
确保试剂或者微孔板完全回温，在实验开始前，将试剂放置盒子外少1小时。 |
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使用错误波长读数，或者酶标仪失灵。 |
确保450nm波长读数，检查酶标仪。 |
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试剂盒处于的条件。 |
检查试剂盒从冰箱拿出使用的次数，检查试剂盒是否放置温度（过冷或者过热）时间太长。 |
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酶标板损坏 |
确保酶标板一直放置于有干燥剂密封的铝箔袋中置于冰箱保存，回温时也是放于铝箔袋回到室温。 |
3.过高的背景值或吸光度（OD值）
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可能原因 |
解决方法 |
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使用了质量差的水。 |
如果使用的水可疑，尝试使用蒸馏水配制洗液。 |
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底物失效。 |
确保加入微孔板前，底物是无色的。 |
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洗涤不当或者洗板机洗板效果不好。 |
采用说明书建议的洗涤次数，每次每孔至少加入250μL洗液。检查洗涤系统，排除故障。 |
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酶标仪失灵。如果OD值读数很高而颜色很浅，那个这是非常可能的情况。 |
使用校正微孔板检查酶标仪，检查光源。 |
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实验室温度过高。 |
保持实验室温度（22.5±2.5）°C，避免在热源或者阳光直射处实验。 |
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试剂混淆，被污染或者配制不当。 |
确保使用正确的试剂，准确配制，避免污染。 |
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