(Taqman探针一步法实时荧光RT-PCR--------免提取)
编号:KA.PCR008.02
规格:48T
介绍:禽流感(Avian influenza)是由A型流感病毒引起的一种人与动物共患病,不仅引起禽类以呼吸系统疾病、产蛋下降乃至急性致死和高死亡率等为特征的烈性传染病,而且可导致人的感染和死亡,严重威胁人类健康。禽流感病毒(Avian influenza virus ,AIV)显著的生物学特征之一是亚型众多,变异频繁,按病原体类型的不同,可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。世界卫生组织(OIE)将其列为必须通报疾病。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种明录》将其列为一类动物疫病。
用途:该试剂盒用于对AIV H5亚型进行检测,有助于对AIV H5亚型的实验室诊断、监测和流行病调查。
原理:本试剂盒采用一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应(One-Step Real Time RT-PCR) ,结合Taqman技术,对特异核酸进行定性或定量检测。
试剂盒的组成
试剂名称 |
数量 |
样本处理液 |
1mL ×1管 |
AIV H5反应液 |
550μL×1管 |
AIV H5酶 |
40μL×1管 |
AIV H5引物探针 |
120μL×1管 |
无核酸水 |
1000μL×1管 |
AIV H5阴性对照 |
1000μL×1管 |
AIV H5阳性对照 |
150μL×1管 |
保存期及贮藏条件:本产品-20℃避光可保存12个月。
样品收集,操作和储存
1. 选择发病早期,病毒含量比较高的咽拭子、泄殖腔拭子、血液等样本,无菌采样并立即送检。
2. 样品短期可在4℃冷藏保存,较长时间保存应在--20℃或者-70℃,并且避免反复冻融。
检测步骤
1.样本处理
取咽拭子、泄殖腔拭子上清液、血清、血浆等样本80μL于0.5mlEP管中,加入20μL样本处理液混匀备检。
备注:组织样本建议采用商品化的核酸提取试剂盒提取核酸,然后再进行后续检测。
2.扩增试剂的准备
将样品数+1份阴性对照+1份阳性对照设为N,计算试剂所需量,反应体系配制见下表
试剂名称 |
N份用量(20μL 体系) |
AIV H5反应液 |
10μL×(N+1) |
AIV H5酶 |
0.5μL×(N+1) |
AIV H5引物探针 |
1.8μL×(N+1) |
无核酸水 |
5.7μL×(N+1) |
将各试剂按照表中用量加入无菌离心管中,充分混匀,短暂离心后在PCR反应管中分别加入18μL混合液。
3.加样
将制备好的样本,阴性对照,阳性对照各取2μL分别加入对应反应管中,加完后盖紧PCR反应管盖,置于PCR仪上。
4.荧光PCR扩增与信号收集
循环数 |
温度(℃) |
时间 |
数据收集位点 |
1 |
45 |
15min |
- |
1 |
95 |
2min |
|
5 |
95 |
10s |
- |
|
45 |
30s |
- |
|
72 |
1min |
- |
40 |
95 |
15s |
- |
|
60 |
1min |
数据收集 |
注:报告基团选FAM,淬灭基团选NONE。
结果成立原则
阳性对照:CT值<30并有明显的扩增曲线。
阴性对照:无CT值或者CT值>37,线性为直线或者轻微斜线,无明显扩增曲线。
以上要求需同时满足,否则本次实验无效,需要重新进行。
结果判定
CT值 |
样本检测结果 |
<30并有明显的扩增曲线 |
阳性,样本中检测出AIV H5亚型。 |
30-37 |
可疑,需重复检测。若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性,否则为阴性。 |
>37并无扩增曲线 |
阴性,样本中未检测出AIV H5亚型。 |
注意事项
1.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制,整个实验过程严格控制污染。
2.PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。
3.反复冻融试剂将减低检测灵敏度,本试剂盒应在5次内用完.
4.-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化,液体融化后需彻底混匀,2000 rpm离心15 s ,使用后立即放回-20 ℃。
5.在RNA提取过程中,避免RNA酶污染,尽量缩短操作时间。
6.注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的成分不要混用。
7.PCR反应管避免气泡存在,管盖需盖紧。